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實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測每個(gè)PCR循環(huán)中的熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板量的定量分析的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)由美國Applied Biosystems公司在1995年推出，標(biāo)志著PCR技術(shù)從定性分析到定量分析的飛躍。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的基本原理包括三個(gè)主要階段，這些階段反映了PCR擴(kuò)增過程中的熒光信號(hào)變化：
1、基線期：在PCR反應(yīng)開始時(shí)，熒光信號(hào)幾乎不變，主要是因?yàn)楸尘盁晒獾拇嬖谘谏w了PCR產(chǎn)物的熒光信號(hào)。這一階段的熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，用于設(shè)置基線。
2、指數(shù)期：隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行，目標(biāo)DNA序列被指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，熒光信號(hào)隨之增加。這一階段熒光信號(hào)呈指數(shù)增長，PCR產(chǎn)物量與起始模板量呈線性關(guān)系，是進(jìn)行定量分析的理想階段。
3、平臺(tái)期：當(dāng)PCR反應(yīng)接近完成時(shí)，由于DNA聚合酶活性下降、底物耗盡或抑制物積累，擴(kuò)增效率降低，熒光信號(hào)的增加趨于平緩，最終停止。這一階段熒光信號(hào)不再顯著增加，PCR產(chǎn)物達(dá)到飽和狀態(tài)。
在指數(shù)期，通過設(shè)定熒光閾值（閾值循環(huán)數(shù)，Ct值），可以準(zhǔn)確地對(duì)樣品中的初始模板量進(jìn)行定量分析。Ct值越小，說明初始模板量越大。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以將Ct值轉(zhuǎn)換為模板的起始拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)序列的定量檢測。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中有幾個(gè)重要的概念，包括擴(kuò)增曲線、基線、熒光閾值和域值循環(huán)數(shù)。
1、擴(kuò)增曲線（amplification curve）: 是在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中監(jiān)測到的熒光信號(hào)隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線。在進(jìn)行PCR反應(yīng)過程中，通過檢測系統(tǒng)對(duì)PCR管內(nèi)的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，最后將熒光信號(hào)值通過成像技術(shù)顯現(xiàn)在計(jì)算機(jī)上。正常的擴(kuò)增曲線包括四個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺(tái)期。
2、基線（baseline）：是背景曲線的一段，在擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線。
3、熒光閾值（threshold）:是在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)）。熒光閾值可以設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。
4、閾值循環(huán)數(shù):表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，CT值越小;起始拷貝數(shù)越少,CT值越大。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出以起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),CT值為縱坐標(biāo)的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要獲得未知模板的CT值,即從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該模板的起始拷貝數(shù)。
